Размножение папоротников посредством спор в культуре in vitro (обзор литературы)

Шелихан Л.А., Некрасов Э.В.

Папоротники как объекты биотехнологии

Папоротники являются споровыми сосудистыми растениями, чьи ископаемые остатки известны из девонского и каменноугольного периодов. Согласно последним классификациям, папоротники вместе с хвощами и псилотовыми составляют группу монилофитов (monilophytes, Smith et al., 2008) или отдел Polypodiophyta (Christenhusz, Chase, 2014). По разным оценкам они включают от 9000 до 10500 видов (Smith et al., 2008; Christenhusz, Chase, 2014) и представлены наземными, эпифитными и водными растениями. Папоротники – преимущественно травянистые растения различных жизненных форм, хотя некоторые их группы или отдельные виды являются древовидными (Рис. 1). Они распространены от тропиков и умеренной зоны до Арктики, от дождевых лесов до альпийского горного пояса и аридных районов. Среди адаптивных преимуществ папоротников выделяют способность к фотосинтезу в условиях пониженной освещенности, высокую устойчивость к дисбалансу питательных веществ в субстрате и мощный арсенал вторичных метаболитов, определяющих устойчивость растений к фитопатогенам, вредителям и травоядным животным (Page, 2002). Эти свойства папоротников имеют большой потенциал для практического использования.

Благодаря способности извлекать, накапливать и обезвреживать токсичные вещества, папоротники рассматривают как средство для фиторемедиации окружающей среды (Dhir, 2018). Накоплены многочисленные сведения по биологической активности вторичных метаболитов из папоротников (Goswami et al., 2016; Baskaran et al., 2018). Многие виды издавна используют в пищу и народной медицине (von Aderkas, 1984; Crowe, 1997; Khrapko, 2007; Kreshchenok, 2008; Liu et al., 2012a; Maroyi, 2014). Папоротники могут быть источниками компонентов для парфюмерной промышленности (Froissard et al., 2011). Велика эстетическая ценность папоротников: их используют при создании и благоустройстве садов, ландшафтном дизайне и озеленении, в качестве комнатных растений и компонентов цветочных композиций, тем самым они вносят определенный вклад в цветочную индустрию (Singh, Johari, 2018). Деградация и уничтожение местообитаний папоротников в результате изменения климата и деятельности человека ведет к сокращению численности и исчезновению их популяций, наносится невосполнимый ущерб биологическому разно- образию растений. Особенно уязвимы узколокальные эндемики и виды на границе ареала. В Красную книгу Российской Федерации (Trutnev et al., 2008) занесены 23 вида таких папоротников.

Первые публикации по культивированию папоротников в условиях in vitro появились в середине 20 века (Wetmore, Morel, 1949; Döpp, 1950; Steeves, Sussex, 1952), хотя работы по проращиванию спор имеют историю, начиная с 18 века (Arnautova, 2008). Целью ранних исследований были особенности роста и развития протонем, полученных при прорастании спор (Miller, Miller, 1961, 1965; Ito, 1969; Weinberg, Voeller, 1969; Wada, Furuya, 1970). С тех пор культуры in vitro нашли применение в исследованиях не только развития папоротников (Li et al., 2013), но и семенных растений (Fang et al., 2017), а также различных аспектов генетики, молекулярной биологии и биотехнологии растений (Johari, Singh, 2018). Культуры тканей папоротников используют также для изучения механизмов устойчивости этих растений к тяжелым металлам (Yoshihara et al., 2005).

Несмотря на многочисленные данные о присутствии биологически активных соединений в папоротниках (Goswami et al., 2016; Baskaran et al., 2018), работ по использованию их культур клеток для получения вторичных метаболитов немного (Svatos, Macek, 1994; Reixach et al., 1996, 1997; Basile et al., 1997). В культуру in vitro были введены различные виды, имеющие медицинское значение, а также съедобные папоротники (Singha et al., 2013a). Кроме того, были предприняты попытки выращивания Anemia tomentosa var. anthriscifolia в культуре in vitro для получения ароматических соединений (Pinto et al., 2013; Castilho et al., 2018).

Наибольшее приложение методы размножения папоротников в условиях in vitro получили в декоративном садоводстве (Fernandez, Revilla, 2003). Только одна голландская фирма Vitro Plus ежегодно выращивает более 30 миллионов декоративных папоротников и поставляет их в 50 стран по всему миру (DutchGlory, 2018). Наконец, методы биотехнологии широко используются для сохранения редких и исчезающих видов (Renner, Randi, 2004; Singha et al., 2013b; Pence, 2014; Shukla, Khare, 2014; Ballesteros, Pence, 2018). Было показано, что инкапсулированные и обработанные стерилизующим агентом споры и гаметофиты Cyathea australis, выращенные in vitro, сохраняют жизнеспособность при криоконсервации (Mikula et al., 2009), что открывает большие возможности для долгосрочного хранения редких видов.

Цель представленного обзора – обобщить литературные данные по введению и размножению папоротников в культуре in vitro при использовании спор в качестве эксплантов.

Особенности размножения папоротников и потенциальные экспланты для введения в культуру in vitro

Выбор эксплантов для введения в культуру in vitro зависит как от целей использования этой культуры, так и от потенциала выбранной части растения для дальнейшего успешного её развития. Жизненный цикл папоротников включает чередование поколений: морфологически сложного диплоидного бесполого спорофита и простого гаплоидного полового гаметофита (Haufler et al., 2016; Johari, Singh, 2018). Гаметофит развивается непосредственно из спор и является самостоятельно живущим организмом, у которого образуются репродуктивные органы (архегонии и антеридии) и гаметы, происходит оплодотворение яйцеклетки. Спорофит развивается из зиготы и на начальных этапах связан с гаметофитом, от которого получает питание. Позже гаметофит отмирает, а спорофит переходит к самостоятельному существованию. В процессе роста и развития спорофита на его вайах формируются спорангии со спорогенной тканью, из которой в результате мейоза образуются споры. На основе морфологии спор папоротники делят на равноспоровые (гомоспоровые) и разноспоровые (гетероспоровые). Равноспоровые папоротники производят только один тип спор, из которых развиваются обоеполые гаметофиты, формирующие как женские, так и мужские половые органы, тогда как разноспоровые папоротники размножаются посредством мегаспор (женские споры) и микроспор (мужские споры), из которых прорастают гаметофиты, производящие только женские и мужские гаметы, соответственно (Johari, Singh, 2018). Из современных папоротников лишь водные из порядка Salviniales являются разноспоровыми (Smith et al., 2008). Подавляющее большинство современных папоротников являются равноспоровыми, однако и в этом случае существуют физиологические механизмы, обеспечивающие обмен генетическим материалом только между разными гаметофитами (Haufler et al., 2016; Rivera et al., 2018a).

Различные нарушения полового процесса, при которых развитие новых растений происходит без слияния гамет, объединяют под термином «апомиксис». Для папоротников апомиксис включает образование нередуцированных спор в результате нарушения мейоза или предшествующего ему митотического деления спороцитов (диплоспория), и образование спорофита из соматических клеток гаметофита (апогамия) (Foster, Gifford, 1974; Liu et al., 2012b). С другой стороны, у папоротников возможно образование гаметофита непосредственно из ткани спорофита без предшествующих этому мейоза и споруляции (апоспория) (Martin et al., 2006). Эти способы неполового размножения нашли применение в биотехнологии (Fernandez, Revilla, 2003; Martin et al., 2006; Johari, Singh, 2018).

Споры папоротников являются удобным объектом для получения культуры in vitro. Естественно, для размножения разноспоровых папоротников в условиях in vitro необходимо использовать как микро-, так и мегаспоры. Для размножения равноспоровых папоротников важно учитывать возможную физиологическую разноспоровость, которая может существенно варьировать между видами одного рода, так и внутри вида (Haufler et al., 2016), и использовать споры от разных родительских растений для успешного полового процесса.

Поскольку гаметофит является свободноживущим организмом, имеет краевую меристему, содержащую цепь одиночных клеток, которые при определенных условиях могут делиться, приводить к регенерации и созданию новых гаметофитов, папоротники возможно клонировать также на этой стадии (Rybczynski et al., 2018). В естественных условиях гаметофиты тоже могут размножаться вегетативно (Arnautova, 2008). В частности, некоторые виды папоротников образуют геммы, которые отделяются от материнского растения и образуют новые гаметофиты (Raghavan, 1989). Размножение гаметофита in vitro может протекать по вегетативному пути (Fernandez, Revilla, 2003), а также в результате каллусогенеза (Joyce et al., 2014). Различные части гаметофита могут различаться по способности образовывать клоны и по жизнеспособности в культуре (Johari, Singh, 2018).

Хорошо известна способность спорофитов папоротников к вегетативному размножению. Это могут быть почки на корневищах, различного рода выводковые почки на поверхности вай и черешков, столоны, клубни, адвентивные почки на стеблях, корневые и листовые геммы (Johns, Edwards, 1991). Вегетативное размножение спорофитов в условиях in vitro позволяет получать растения идентичные материнскому. Для этого в качестве эксплантов используют изолированные фрагменты органов растения, например, части корневища (Higuchi, Amaki, 1989; Thakur et al., 1998; Hedge et al., 2006) или фрагменты стебля и вай папоротника (Hicks, von Aderkas, 1986; Camloh, Ambrozic-Dolinsek, 2010), столоны, выводковые почки и т.д. (Rybczynski et al., 2018). Работы по использованию вегетативных частей спорофитов в качестве эксплантов для культивирования in vitro в этом обзоре подробно не рассматриваются. С ними можно ознакомиться в обзорах (Singha et al., 2013a, Rybczynski et al., 2018) и приведенных выше ссылках.

Размножение папоротников в культуре in vitro

Размножение папоротников in vitro включает несколько этапов, которые зависят от типа экспланта, связаны с фазами развития растения и, в свою очередь, определяют набор оптимальных компонентов питательных сред, необходимость включения регуляторов роста и условия выращивания. Для размножения посредством спор значимыми этапами являются: инициация прорастания спор, рост и размножение гаметофитов, экспрессия половых органов, оплодотворение, рост и дифференциация спорофитов, укоренение и акклиматизация новых растений (Haddad, Bayerly, 2014; Johari, Singh, 2018). Кроме папоротников, культивирование in vitro известно и для других споровых растений. Для хвощей такие исследования описаны в работах (Kuriyama et al., 1989; Kuriyama et al., 1992; Guillon, Raquin, 2002).

Введение в культуру in vitro

Для получения спор спороносные вайи папоротников собирают в период зрелости. На всхожесть спор могут влиять температура окружающей среды, когда споры были собраны, и степень оводненности спор (Parajuli, Joshi, 2014). Вайи предварительно просушивают для высвобождения спор при 20°C (Makowski et al., 2016; Babenko et al., 2018) или 30°C (Renner, Randi, 2004), при необходимости используют иглу для их высвобождения или метод фильтрации (Renner, Randi, 2004). Однако для лучшего отделения спор и спорангиев от растительного материала, их просеивают через тонкую сетчатую ткань или сито (Jang et al., 2017; Rivera et al., 2018b). Очищенный материал либо сразу применяют в экспериментах, либо оставляют на хранение, например, при 4°C (Chang et al., 2007; Jang et al., 2017; Rivera et al., 2018b).

Хранение спор негативно сказывается на их дальнейшем развитии в культуре in vitro. По данным Л.М. Бабенко и соавторов (Babenko et al., 2018) прорастание свежесобранных спор Polystichum aculeatum составило 80–95% и этот показатель снижался до 20% при хранении при 20°C в течение 1,5–2 лет. Хранение спор Platycerium bifurcatum в течение 14 мес. в большей степени снижало прорастание стерилизованных спор, чем необработанных (Camloh, 1999). Тем не менее, известны случаи успешного введения в культуру in vitro спор из гербарных образцов после предварительной дезинфекции путем промораживания при –18°C и хранения в неконтролируемых условиях с ежегодной фумигацией (Moura et al., 2015). При этом всхожесть 6-летних спор Anogramma leptophylla и 8-летних Cheilanthes acrostica и Cosentinia vellea была ниже 50% (Moura et al., 2015). Споры Ceratopteris richardii, напротив, нуждались в хранении несколько месяцев, чтобы достигнуть максимальной всхожести (Warne, Hickok, 1987).

Для поверхностной стерилизации спор используют различные стерилизующие агенты (Табл. 1), среди которых наиболее популярным является гипохлорит натрия (NaClO) и коммерческие отбеливатели на его основе. Добавление в качестве эмульгатора детергентов (Твин-20, Твин-80 или Типол) к стерилизующему агенту способствует лучшему смачиванию поверхности спор и, следовательно, повышает эффективность процесса (Табл. 1). Иногда перед стерилизацией споры замачивают в воде или растворе детергента (например, 0,1 г/л Твин-20) от 30 мин до 24 ч (Fernandez et al., 1997a; Wu et al., 2010; Jang et al., 2017; Castilho et al., 2018; Rivera et al., 2018b). В качестве других стерилизующих агентов для спор применяют гипохлорит кальция (Сa(ClO)2 ) и перекись водорода (Табл. 1). Иногда применяют двухступенчатую стерилизацию, при которой на первом этапе споры обрабатывают 70–80% этиловым спиртом (Табл. 1). В качестве третьего этапа могут добавлять раствор фунгицида (Pinto et al., 2013). После стерилизации материал промывают несколько раз стерильной водой для удаления стерилизующего агента. Для стерилизации и последующей промывки споры помещают в фильтровальные пакетики или суспендируют их в стерилизующем растворе с последующим центрифугированием (Fernandez, Revilla, 2003; Makowski et al., 2016; Babenko et al., 2018). Посев спор на питательную среду осуществляют путем переноса определенного объема суспензии спор на питательную среду (Castilho et al., 2018), промоканием питательной среды фильтровальной бумагой со спорами (Makowski et al., 2016), либо с помощью микробиологической петли и других инструментов.

Таблица 1. Стерилизующие агенты, рекомендуемые для поверхностной стерилизации спор папоротников

Большое значение имеет состав компонентов питательных сред для культивирования, поскольку такие среды обеспечивают новые растения необходимыми веществами для нормального роста. Состав питательных сред варьирует в зависимости от вида культивируемых растительных объектов и этапов размножения. Все питательные среды предварительно стерилизуют путем автоклавирования для предотвращения заражения микроорганизмами. В качестве питательных сред используют прописи Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige, Skoog, 1962), Кнопа (Knop, 1865), Дайера (Dyer, 1979), Клековского (СК) (Klekowski, 1969), Мейера (Meyer et al., 1955), Кнудсона (Knudson, 1946) и Нича (Nitsch, Nitsch, 1969). Применяют как оригинальные прописи, так и их модификации, и дополнения к ним, в зависимости от этапа размножения (Табл. 2). Чаще всего в литературных источниках упоминается питательная среда МС и ее вариации, которые обычно заключаются в пропорциональном уменьшении содержания макросолей (1/2, 1/4 и т.д.) по сравнению с исходной прописью.

Споры содержат все питательные вещества, необходимые для раннего развития гаметофита, поэтому, по мнению Menendez и соавторов (2010), использование низкопитательной среды на начальных стадиях прорастания, таких как среда Кнудсона или разведенная среда МС, может быть оправдано. Так, наибольшее прорастание спор Drynaria fortunei наблюдали при содержании солей МС в 4 раза меньше (1/4МС) исходной прописи (1МС), однако гаметофиты на такой среде развивались медленнее по сравнению с 1/2МС. Среды на основе 1МС и 2МС подавляли как прорастание спор, так и дальнейшее развитие гаметофитов (Chang et al., 2007). По другим данным (Jang et al., 2017), прорастание спор не зависит от состава и концентрации солей в среде, однако эти параметры влияют на дальнейшее развитие гаметофитов.

Прорастание спор возможно в отсутствие углеводов в питательной среде (Raghavan, 1989), однако добавление сахарозы способствовало увеличению доли проросших спор (Sheffield et al., 2001). Напротив, концентрация сахарозы выше определенного уровня (1,5–2%) существенно снижала прорастание (Chang et al., 2007; Wu et al., 2010). Присутствие 1–5% сахарозы в питательной среде также уменьшало долю проросших спор в работе (Renner, Randi, 2004). Более того, эффект сахарозы зависел от концентрации солей в питательной среде: при пониженной концентрации солей (1/4МС) сахароза стимулировала прорастание, тогда как при более высоких концентрациях (1/2МС, 1МС) эффект отсутствовал (Wu et al., 2010). По сравнению с другими углеводами (мальтоза, глюкоза, фруктоза) сахароза была наиболее эффективна (Chang et al., 2007).

Таблица 2. Культуральные среды и условия культивирования для папоротников

Прорастание спор находится под контролем различных факторов окружающей среды, включая температуру, освещение, pH среды, газовый состав и различные химические соединения (Raghavan, 1989; Suo et al., 2015). Хотя эти эффекты зачастую бывают видоспецифичными, существуют общие требования, имеющие отношение к культивированию папоротников in vitro. Для оптимального прорастания необходима температура 20–25°C (Raghavan, 1989; Suo et al., 2015), хотя для спор Ophioglossum engelmann необходима стратификация с чередованием теплых и холодных условий (Raghavan, 1989). Большинство папоротников нуждаются в освещении для прорастания спор, причем на прорастание влияют продолжительность, интенсивность и спектральный состав освещения. Как правило, папоротники, имеющие фотосинтезирующие гаметофиты, нуждаются в интенсивном, продолжительном освещении для прорастания спор и не прорастают в темноте (Raghavan, 1989; Chang et al., 2007; Wu et al., 2010; Suo et al., 2015). Для многих видов свет в красной области является оптимальным, тогда как дальний красный и синий подавляют прорастание спор (Raghavan, 1989; Chang et al., 2007; Suo et al., 2015). Влияние параметров освещения на прорастание спор может варьировать даже для одного вида в зависимости от освещения во время образования спор, места и времени сбора спор и условий их хранения (Raghavan, 1989). На молекулярном уровне эффекты освещения зависят от фоторецепторов (фитохром и криптохром), присутствующих в спорах, под контролем которых находится первый клеточный митоз споры (Suo et al., 2015).

Для большинства видов оптимальные значения pH среды для прорастания спор находятся в слабокислой и нейтральной областях (Табл. 2), однако для некоторых видов нужны более кислые или щелочные условия в соответствии с кислотностью почв, на которых растения произрастают в естественных условиях (Raghavan, 1989; Chang et al., 2007; Suo et al., 2015).

Обычно споры проращивают в условиях in vitro без добавления регуляторов роста (Табл. 2). По-видимому, собственных эндогенных гормонов для этого достаточно (Pinto et al., 2013). Тем не менее известно, что регуляторы роста оказывают влияние на прорастание спор. Гиббереллиновая кислота (ГК3) способна обращать ингибирующее действие темноты у некоторых видов и вызывать прорастание спор (Raghavan, 1989; Suo et al., 2015). Аналогичным действием обладает гиббереллиноподобный гормон, названный антеридиогеном, способный вызывать образование антеридиев на поверхности гаметофитов и выделенный из многих папоротников (Suo et al., 2015). С другой стороны, ГК3 ингибировала прорастание спор Polystichum aculeatum в концентрациях 10–5–10–6 М на 35–60% (Babenko et al., 2018). В этой же работе было показано, что цитокинин бензиламинопурин (БАП) ингибирует прорастание спор только при концентрации 10–5 М и не влияет при более низких концентрациях. Ауксин индолилуксусная кислота (ИУК) существенно снижал прорастание спор Dipteris wallichii (Singha et al., 2013b).

Среди других факторов, способных влиять на прорастание спор в условиях in vitro, называют плотность спор на поверхности среды. Как слишком высокая, так и слишком низкая плотность спор отрицательно сказываются на скорости прорастания, хотя имеющиеся данные по оптимальной плотности спор находятся в очень большом диапазоне (Suo et al., 2015). Добавление жидкой воды на поверхность питательной среды может способствовать прорастанию спор (Fernandez et al., 1999). Споры возможно проращивать на жидкой среде как в отсутствие сахарозы (Marimuthu, Manickam, 2011), так и с добавлением 2% сахарозы (SimoesCosta et al., 2015).

Развитие и размножение гаметофитов

На Рис. 2 показаны некоторые этапы развития гаметофитов. По данным разных авторов появление гаметофитов при прорастании спор на питательной среде происходит в течение 1–4 недель (Fernandez et al., 1993; Chang et al., 2007; Khan et al., 2008; Mikula et al., 2009; Soare et al., 2010; Simoes-Costa et al., 2015; de Vargas, Droste, 2014; Moura et al., 2015; Babenko et al., 2018; Castilho et al., 2018). Прорастание спор Adiantum capillus-veneris наблюдали через 3–5 дней (Maridass et al., 2010). Споры Pronephrium triphyllum начали прорастать через 3–4 недели, а Sphaerostephanos unitus – через 35 дней (Marimuthu, Manickam, 2011). Для различных древовидных папоротников время прорастания спор составило от 4 до 16 недель (Goller, Rybczynski, 2007).

Для массового получения папоротников гаметофит, выращенный из спор, можно использовать непосредственно, т.е. в результате образования гамет и сингамии получать спорофиты. Перед экспрессией половых органов гаметофит можно предварительно мультиплицировать, увеличивая копии потенциальных продуцентов спорофитов. Наконец, в результате апогамии спорофиты могут быть индуцированы из ткани гаметофита без оплодотворения.

Размножение гаметофитов требует более высоких концентраций солей по сравнению с прорастающими спорами, хотя часто используют тот же состав среды, что и для прорастания спор (Табл. 2). Вместе с тем, среды, обогащенные макроэлементами, например, МС, задерживают развитие архегониев и антеридиев. Напротив, более бедные по составу и/или концентрации солей среды (например, СК) задерживают пролиферацию гаметофитов, но способствуют образованию антеридий (Fernandez et al., 1997a). Очень высокие концентрации макросолей в среде Кнопа вызывали быстрый рост проталлия Dryopteris nipponensis по сравнению со средой МС и ее разбавленными вариантами (Jang et al., 2017). Повышенное содержание солей МС в питательной среде (1МС) нарушало развитие гаметофитов Adiantum reniforme var. sinense, тогда как их снижение (1/4МС) было более благоприятным для развития гаметофитов в нормальный сердцевидный заросток. Тем не менее, полная среда МС способствовала развитию репродуктивных органов, особенно архегониев, а добавление сахарозы до 3% еще более усиливало их развитие (Wu et al., 2010). Не было различий по степени пролиферации гаметофитов Osmunda regalis между различными разведениями среды МС (1/2, 1/4 или 1/8МС) и средой Кнопа (Makowski et al., 2016).

Присутствие азота в нитратной и аммонийной форме оказывало положительный эффект на развитие гаметофитов D. nipponensis по сравнению с присутствием только одной формы (Jang et al., 2017). Аммонийный азот, напротив, задерживал рост проталлия Osmunda japonica, так что азот в форме нитрата был предпочтительным (Shin, Lee, 2009). Исключение нитрата аммония и витаминов из сред на основе МС увеличивало число гаметофитов O. regalis и их пролиферацию (Makowski et al., 2016). Добавление дигидрофосфата натрия (NaH2 PO4) в питательную среду оказывает видоспецифичное влияние на гаметофит. Например, кластеры гаметофитов Anogramma leptophylla и Cosentinia vellea увеличивались в диаметре в присутствии фосфата, тогда как для гаметофитов Cheilanthes acrostica такого эффекта не было (Moura et al., 2015).

Включение сахарозы в состав питательной среды в невысоких концентрациях (1–3%) обычно усиливает рост гаметофитов (Renner, Randi, 2004; Menendez et al., 2010; Jang et al., 2017). Присутствие сахарозы задерживало развитие репродуктивных органов у гаметофита Cyathea lepifera (Kuriyama et al., 2004). Сахароза имела слабый стимулирующий эффект на рост гаметофитов или он отсутствовал у трех видов папоротников (Anogramma leptophylla, Cosentinia vellea, Cheilanthes acrostica), хотя низкие концентрации сахарозы (0,5–1%) сопровождались увеличением числа спорофитов (Moura et al., 2015). Гаметофиты Drynaria fortunei на среде с сахарозой проходили стадии развития быстрее, чем в присутствии мальтозы и, особенно, глюкозы (Chang et al., 2007). В отсутствии минеральных солей сахароза была токсичной для гаметофитов, вызывая их некроз (Fernandez et al., 1999).

Значение pH среды оказывало влияние на количество архегониев на гаметофите Drynaria fortunei: их было больше при pH 7,7, чем при 6,7 и сильно снижалось как при кислых, так и щелочных значениях (Chang et al., 2007). Спектральный состав света влиял как на форму и размеры гаметофита, так и развитие половых органов D. fortunei: если синий (450 нм) и белый (380–780 нм) свет вызывали образование нормальной сердцевидной формы гаметофитов, то красный (660 нм) и дальний красный (735 нм) способствовали росту удлиненных гаметофитов. Синий цвет способствовал образованию архегониев, красный – антеридиев, белый – как архегониев, так и обоеполых гаметофитов, тогда как дальний красный подавлял образование половых органов (Chang et al., 2007).

Регуляторы роста оказывают влияние как на рост и развитие таллома гаметофитов, так и на образование репродуктивных органов и последующее формирование спорофитов. Цитокинин БАП в концентрации 4,4 мкМ задерживал нормальное развитие гаметофита Blechnum spicant (Menendez et al., 2009). БАП в концентрациях 10–8–10–5 М нарушал развитие протонемы Polystichum aculeatum, вызывая разной степени разветвления и хаотичное разрастание проталлия в зависимости от концентрации цитокинина. При более низких концентрациях БАП (10–6–10–8 М) нормальное развитие гаметофита восстанавливалось после 1,5 мес. культивирования (Babenko et al., 2018). Сочетание БАП и ауксина нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрациях 1–4 мг/л и 0,1–0,5 мг/л, соответственно, стимулировали размножение гаметофитов Asplenium nidus. При этом оптимальные концентрации составляли 2 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК, а более высокие вызывали побурение ткани (Khan et al., 2008). Включение БАП и НУК в питательную среду в таких же концентрациях задерживало рост и развитие гаметофитов четырех видов папоротников (Cyathea australis, C. cooperi, C. cunninghamii и Dicksonia antarctica) (Moura et al., 2012). ИУК усиливал рост гаметофитов Dipteris wallichii в концентрации 0,15 мг/л, дальнейшее увеличение концентрации ауксина вело к снижению роста (Singha et al., 2013b). Действие цитокинина кинетина (Кин) на половую дифференциацию гаметофита Osmunda regalis зависело от концентрации: низкие концентрации увеличивали долю женских гаметофитов, а высокие – уменьшали долю женских и увеличивали мужских и бесполых гаметофитов (Greer et al., 2012). Кинетин в сочетании с НУК вызывал увеличение размеров гаметофита при оптимальном соотношении Кин 3,0 мг/л и НУК 0,1 мг/л (Haddad, Bayerly, 2014). БАП в низких концентрациях (0,3 и 3 мкМ) способствовал образованию антеридий у Blechnum spicant (Fernandez et al., 1997a). Более высокие концентрации БАП (4,4 мкМ) сильно снижали образование архегониев по сравнению с контролем у этого же папоротника (Menendez et al., 2009). Жасмониевая кислота (ЖК) в концентрациях до 1 мкМ вызывала рост ризоидов, деление клеток и переход к планарной стадии у гаметофитов Platycerium bifurcatum (Camloh et al., 1996). ЖК стимулировала образование спорофитов на гаметофитах Anemia tomentosa, а ИУК, напротив, подавляла этот процесс (Castilho et al., 2018).

Гиббереллинам и гиббереллиноподобным веществам, к которым относится и антеридиоген, принадлежит ключевая роль в формировании полового полиморфизма у папоротников (Atallah, Banks, 2015). В большинстве случаев гиббереллины вызывают образование антеридий и задерживают образование архегоний. ГК3 в составе питательной среды не влияла на образование протонемы Polystichum aculeatum, однако вызывала различные деформации таллома, а репродуктивные органы не образовывались вовсе (Babenko et al., 2018).

Для развития гаметофитов и последующего образования спорофитов необходимо учитывать физическое состояние среды и наличие свободной воды. Например, сухой вес гаметофитов Osmunda regalis, культивируемых на среде с 0,35% агаром увеличивался по сравнению с более твердой средой, содержащей 0,7% агара (Fernandez et al., 1997b), а у Blechnum spicant жидкая среда была благоприятна для роста гаметофитов, но гаметофиты при этом были гипергидратированы (Fernandez et al., 1997a). Присутствие капельной воды необходимо для перемещения мужских гамет и, в целом, периодическое добавление воды полезно для культуры папоротников (Menendez et al., 2010).

Плотность гаметофитов на питательной среде влияет на рост и половую экспрессию. В популяциях с низкой плотностью гаметофиты обычно бывают женскими или обоеполыми, крупными по размеру, в популяциях с высокой плотностью встречаются небольшие, лопатовидные и бесполые. Возможно это связано с конкуренцией за питательные вещества или наличием аллелопатических веществ. Видимо, необходимо сеять споры более разрозненно, что привело бы к последующему развитию гаметофитов обоих полов и успешному производству спорофитов (Menendez et al., 2010).

Механическая гомогенизация гаметофитов, выращенных в условиях in vitro, является методом массового получения как гаметофитов, так и спорофитов, особенно для папоротников с коротким жизненным циклом (Fernandez et al., 1999; Somer et al., 2010). Гаметофиты фрагментируют блендером в течение короткого времени в асептических условиях. Первоначально экспланты могут становиться бурыми и омертвевшими, но постепенно некоторые клетки начинают делиться и образовывать новые гаметофиты и спорофиты (Fernandez et al., 1993). Гомогенизированные гаметофиты лучше регенирируют при культивировании в жидкой среде, вероятно из-за лучшего поглощения питательных веществ. Регуляторы роста в питательную среду для культивирования гомогенатов гаметофитов не добавляли (Fernandez et al., 1999; Somer et al., 2010). Полученные культуры успешно регенирировали новые гаметофиты, но воспроизводство новых спорофитов было скорее видоспецифичным. Так, некоторые виды (Woodwardia virginica, Davallia canariensis) образовывали спорофиты после гомогенизации гаметофитов, у других (Asplenium nidus, Osmunda regalis) образование спорофитов не наблюдали (Fernandez et al., 1993; Fernandez et al., 1999; Somer et al., 2010).

Размножение папоротников in vitro может ограничиваться на стадии гаметофита (Chang et al., 2007; Wu et al., 2010; Kodym et al., 2016; Jang et al., 2017). Так, 5-ти месячные гаметофиты Drynaria fortunei, размноженные в условиях in vitro, помещали на почвенную смесь и через 14 недель в тепличных условиях развивались молодые спорофиты (Chang et al., 2007). Также гаметофиты Adiantum reniforme var. sinense, перенесенные на песчано-почвенный субстрат, успешно развивали спорофиты (Wu et al., 2010). Более сложная процедура адаптации гаметофитов и получения спорофитов Pteridium esculentum описана в работе (Kodym et al., 2016). Гаметофиты Cyathea australis, полученные в условиях in vitro и перенесенные на субстрат (торф – перлит, 1:1), существенно не отличались или даже уступали по развитию спорофитов различным вариантам культивирования in vitro (Moura et al., 2012). Тогда как в случае Woodwardia fimbriata наилучшие результаты по образованию спорофитов гаметофитами были получены именно на смеси торфа и перлита по сравнению с культивированием гаметофитов in vitro (Simoes-Costa et al., 2015).

Рост гаметофита обычно прекращается при развитии спорофита. Однако для разных видов в культуре in vitro наблюдали как прекращение роста гаметофитов, так и продолжение роста одновременно с ростом спорофита или даже после того, как спорофит сформировался (Fernandez et al., 1999).

Развитие и размножение спорофитов

Первые спорофиты, полученные от гаметофитов, появлялись в культуре на 4–5 неделе (Castilho et al., 2018), через 3 месяца от начала эксперимента (Simoes-Costa et al., 2015), через 90–120 дней (Moura et al., 2015; Babenko et al., 2018) и через 6 месяцев (Fernandez et al., 1993; Renner, Randi, 2004). Также, появление молодых спорофитов было отмечено после 1 года существования культуры гаметофитов в работе (Mikula et al., 2015). Для нескольких видов древовидных папоротников время появления спорофитов варьировало от 4 до 14 месяцев (Goller, Rybczynski, 2007). На срок образования спорофитов влияет состав питательной среды: для гаметофитов Cyathea australis появление спорофитов варьировало от 46 до 83 дней в зависимости от питательной среды (Moura et al., 2012).

Развитие спорофитов Osmunda regalis наступало раньше и в большем количестве на питательных средах с наименьшим содержанием солей МС (1/8 по сравнению с 1/4 и 1/2), а исключение нитрата аммония из среды значительно усиливало рост спорофитов (Makowski et al., 2016). У Cyathea lepifera крайне разбавленный раствор МС (1/80) был наиболее эффективным для образования спорофитов по сравнению с менее разбавленными растворами (Kuriyama et al., 2004). Исключение солей и сахарозы из питательной среды вело к увеличению числа спорофитов в гомогенизированной культуре гаметофитов (Fernandez et al., 1997a). С другой стороны, показано положительное влияние дигидрофосфата натрия на образование спорофитов Asplenium nidus (Khan et al., 2008) и четырех видов древовидных папоротников (Moura et al., 2012). В работах (Moura et al., 2015; Simoes-Costa et al., 2015) добавление NaH2 PO4 в питательную среду существенно не влияло на количество спорофитов. Таким образом, дигидрофосфат натрия, вероятно, в зависимости от вида папоротника может облегчать получение спорофитов, либо вовсе не вызывать никаких изменений.

Гомогенизация ткани спорофитов, выращенных в асептических условиях, также нашла применение для воспроизводства новых растений (Fernandez et al., 1993). Культивирование гомогенатов спорофитов нескольких видов папоротников на жидкой среде МС способствовало преимущественному развитию спорофитов, однако в присутствии БАП (4,4 мкМ) одни виды (Adiantum capillus-veneris, Davallia canariensis, Polypodium cambricum) давали недифференцированные агрегаты клеток и апоспоровые гаметофиты, другие (Asplenium adiantumnigrum) – спорофиты и гаметофиты в близких пропорциях (Somer et al., 2010). Гомогенат спорофитов Asplenium nidus регенерировал как новые спорофиты, так и апоспоровые гаметофиты (Fernandez et al., 1993). Добавление регуляторов роста к гомогенизированной культуре спорофита A. nidus имело разнонаправленное действие (Menendez et al., 2011): ГК3 и БАП вызывало образование пролиферирующих структур, которые не вели к формированию спорофитов, тогда как ИУК способствовала росту спорофитов. Различные сочетания БАП и 2,4- дихрофеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) стимулировали образование гаметофитов на эксплантах спорофитов Rumohra adiantiformis, выращенных in vitro (Avila-Perez et al., 2011). Образование апоспоровых гаметофитов возможно также на среде без регуляторов роста (Avila-Perez et al., 2011; Menendez et al., 2011). Кинетин в сочетании с ИУК способствовал увеличению массы спорофитов Dipteris wallichii (Singha et al., 2013b). Апогамное развитие спорофитов на гаметофитах Pteris tripartita вызывали как цитокининами (БАП, Кин), так и ГК3 в высоких концентрациях (1–5 мг/л, оптимум при 4 мг/л) (Ravi et al., 2015).

Укоренение и акклиматизация

Образование корней может происходить спонтанно на культуральной среде в отсутствии регуляторов роста (Avila-Perez et al., 2011; Haddad, Bayerly, 2014). Способность ауксинов стимулировать корнеобразование была показана в ряде работ, хотя тип ауксина и оптимальные концентрации различались. НУК в концентрации 0,01 мг/л увеличивал количество и длину корней Rumohra adiantiformis (Avila-Perez et al., 2011). Укоренение спорофитов Asplenium nidus было оптимальным при концентрации индолилмасляной кислоты (ИМК) 2 мг/л (Khan et al., 2008). Также для A. nidus было обнаружено, что НУК стимулировал образование корней, увеличивал количество укорененных растений, увеличивал длину корней при оптимальной концентрации 1 мг/л (Haddad, Bayerly, 2014). Для укоренения Adiantum capillus-veneris использовали сочетание ауксинов – 2,4-Д и ИМК, проявлявших максимальный эффект при довольно высоких концентрациях: 0,75 и 1,50 мкМ, соответственно (Maridass et al., 2010). Спорофиты способны образовывать корни в присутствии цитокининов в сочетании с ауксинами (Кин и ИУК для Dipteris wallichii) (Singha et al., 2013b), так и в отсутствии последних (БАП или Кин для Pteris tripartita) (Ravi et al., 2015). Для P. tripartita также было показано стимулирующее действие гиббереллина ГК3 (Ravi et al., 2015). В некоторых случаях молодые спорофиты переносили на субстрат для акклиматизации без предварительного укоренения (Moura et al., 2015).

Для акклиматизации сформировавшиеся спорофиты (Marimuthu, Manickam, 2011; Ravi et al., 2015) или группы гаметофитов (Wu et al., 2010; Jang et al., 2017) отмывают от остатков агара в проточной воде для уменьшения последующего заражения и пересаживают в предварительно стерилизованные горшки с субстратом, которые помещают в атмосферу с высокой влажностью (70–95%). В качестве субстрата обычно используют торф и смеси на его основе (Wu et al., 2010; Simoes-Costa et al., 2015; Moura et al., 2015). Однако для определенных видов рекомендуют использовать песок (Khan et al., 2008), комбинации песка и навоза (Haddad, Bayerly, 2014), смесь песка, садовой земли и навоза (1:2:1) (Marimuthu, Manickam, 2011); смесь песка, земли и вермикулита (1:1:1) (Ravi et al., 2015), смесь земли и разложившегося гранита (2:1) (Jang et al., 2017). Для поддержания высокой влажности могут применяться климатические камеры, теплицы с установками искусственного тумана или пленочные укрытия. При этом необходимо осуществлять своевременный полив растений. Температура поддерживается на уровне 22–25°C, фотопериод обычно составляет 16 ч. Влажность воздуха постепенно снижают до уровня окружающей среды, приоткрывая пленочные укрытия или путем постепенного перфорирования пленки.

Заключение

Как следует из приведенного обзора, накоплен обширный материал по культивированию папоротников в условиях in vitro. Исходя из литературных данных, условия введения в культуру in vitro разных видов папоротников могут значительно различаться. Такие факторы, как состав питательной среды, наличие регуляторов роста, свет, температура, влажность, pH имеют большое значение для успешного размножения. Это обуславливает необходимость подбора оптимальных условий для каждого вида папоротника, который предполагается размножать в условиях in vitro. Тем не менее, литературные данные позволяют тестировать уже известные варианты оптимальных условий культивирования и модифицировать их для конкретных видов.

Шелихан, Л. А. Размножение папоротников посредством спор в культуре in vitro (обзор литературы) / Л. А. Шелихан, Э. В. Некрасов // Бюллетень Ботанического сада-института ДВО РАН. – 2018. – № 20. – С. 23-42.